Il grado di purezza delle proteine richiesto dipende dall'uso finale previsto della proteina.
Per alcune applicazioni, un estratto grezzo è sufficiente. Tuttavia, per altri usi, come negli alimenti e nei prodotti farmaceutici, è richiesto un alto livello di purezza. Per raggiungere questo obiettivo vengono generalmente utilizzati diversi metodi di purificazione delle proteine, in una serie di passaggi di purificazione.
Ogni passaggio di purificazione delle proteine di solito causa un certo grado di perdita del prodotto. Pertanto, una strategia di purificazione delle proteine ideale è quella in cui viene raggiunto il più alto livello di purificazione nel minor numero di passaggi. La selezione di quali passaggi utilizzare dipende dalla dimensione, carica, solubilità e altre proprietà della proteina bersaglio. Le seguenti tecniche sono più appropriate per la purificazione di una singola proteina citosolica. La purificazione dei complessi proteici citosolici è più complicata e di solito richiede l'applicazione di metodi diversi.
Primi passi per la purificazione delle proteine
Il primo passo nella purificazione delle proteine intracellulari (all'interno della cellula) è la preparazione di un estratto grezzo .
L'estratto conterrà una miscela complessa di tutte le proteine del citoplasma cellulare e alcune macromolecole aggiuntive, cofattori e nutrienti. L'estratto grezzo può essere utilizzato per alcune applicazioni in biotecnologia, tuttavia, se la purezza è un problema, devono essere seguite le successive fasi di purificazione.
Gli estratti di proteine grezze vengono preparati rimuovendo i detriti cellulari generati dalla lisi cellulare, che si ottiene usando sostanze chimiche ed enzimi , sonicazione o una stampa francese. I detriti vengono rimossi mediante centrifugazione e il supernatante viene recuperato. Preparazioni grezze di proteine extracellulari possono essere ottenute semplicemente rimuovendo le cellule mediante centrifugazione.
Per alcune applicazioni biotecnologiche , c'è una richiesta di enzimi termostabili : enzimi che possono tollerare alte temperature senza denaturazione e mantenendo un'attività specifica elevata. Gli organismi che li producono sono talvolta chiamati estremofili. Un facile approccio per purificare una proteina resistente al calore è quello di denaturare le altre proteine nella miscela riscaldando, quindi raffreddando la soluzione (permettendo così all'enzima termostabile di riformare o ridisciogliere, se necessario.) Le proteine denaturate possono quindi essere rimosse mediante centrifugazione.
Passaggi di purificazione intermedia
In passato, un secondo passo comune per purificare una proteina da un estratto grezzo era la precipitazione in una soluzione con elevata forza osmotica (cioè soluzioni saline). Gli acidi nucleici nell'estratto grezzo possono essere rimossi mediante precipitazione di aggregati formati con streptomicina solfato o protamina solfato.
La precipitazione proteica viene solitamente effettuata usando il solfato di ammonio come sale.
Diverse proteine precipiteranno in diverse concentrazioni di solfato di ammonio . In generale, le proteine di peso molecolare più elevato precipitano in concentrazioni inferiori di solfato di ammonio. La precipitazione del sale non porta solitamente ad una proteina altamente purificata, ma può aiutare ad eliminare alcune proteine indesiderate in una miscela e concentrando il campione. I sali nella soluzione vengono quindi rimossi mediante dialisi attraverso tubi di cellulosa porosa, filtrazione o cromatografia di esclusione di gel.
I moderni protocolli biotech traggono spesso vantaggio dai numerosi kit disponibili in commercio che forniscono soluzioni pronte per le procedure standard. La purificazione delle proteine viene spesso eseguita utilizzando filtri e colonne di filtrazione gel preparate. Tutto quello che devi fare è seguire le istruzioni e aggiungere il volume giusto della soluzione giusta e attendere il tempo specificato mentre raccogli l'eluente (quello che esce dall'altra parte della colonna) in una nuova provetta.
- I metodi cromatografici possono essere applicati utilizzando colonne da banco o apparecchiature HPLC automatizzate. La separazione mediante HPLC può essere effettuata mediante metodi in fase inversa, a scambio ionico o di esclusione delle dimensioni e campioni rilevati mediante array di diodi o tecnologia laser.
Visualizzazione delle proteine e valutazione della purificazione
- La cromatografia in fase inversa (RPC) separa le proteine in base alla loro relativa idrofobicità . Questa tecnica è altamente selettiva ma richiede l'uso di solventi organici. Alcune proteine sono permanentemente denaturate da solventi e perderanno funzionalità durante RPC. Pertanto questo metodo non è raccomandato per tutte le applicazioni, in particolare se è necessario che la proteina bersaglio mantenga l'attività.
- La cromatografia a scambio ionico si riferisce alla separazione delle proteine basata sulla carica . Le colonne possono essere preparate per lo scambio di anioni o lo scambio di cationi. Le colonne di scambio anionico contengono una fase stazionaria con una carica positiva che attrae le proteine caricate negativamente. Le colonne di scambio cationico sono l'inverso, perline caricate negativamente che attraggono le proteine positivamente caricate. L'eluizione della (e) proteina (e) bersaglio (i) viene effettuata cambiando il pH nella colonna, il che si traduce in una modifica o neutralizzazione dei gruppi funzionali carichi di ciascuna proteina.
- La cromatografia ad esclusione dimensionale ( filtrazione su gel ) separa le proteine più grandi da quelle piccole poiché le molecole più grandi viaggiano più velocemente attraverso il polimero reticolato nella colonna cromatografica. Le grandi proteine non si adattano ai pori del polimero mentre le proteine più piccole lo fanno e impiegano più tempo a viaggiare attraverso la colonna di cromatografia, attraverso la loro via meno diretta. L'eluato viene raccolto in una serie di tubi che separano le proteine in base al tempo di eluizione. La filtrazione su gel è uno strumento utile per concentrare un campione di proteine poiché la proteina bersaglio viene raccolta in un volume di eluizione più piccolo rispetto a quello inizialmente aggiunto alla colonna. Tecniche di filtrazione simili potrebbero essere utilizzate durante la produzione di proteine su larga scala a causa della loro economicità.
- La cromatografia di affinità è una tecnica molto utile per "lucidare" o completare il processo di purificazione delle proteine. Le sfere nella colonna cromatografica sono reticolate con ligandi che si legano specificamente alla proteina bersaglio. La proteina viene quindi rimossa dalla colonna risciacquando con una soluzione contenente ligandi liberi. Questo metodo fornisce i risultati più puri e la massima attività specifica rispetto ad altre tecniche.
- SDS-PAGE è l'elettroforesi su gel di poliacrilammide, eseguita in presenza di SDS (sodio dodecil solfato) che si lega alle proteine dando loro una grande carica negativa netta. Poiché le cariche di tutte le proteine sono abbastanza simili, questo metodo li separa quasi interamente in base alle dimensioni. SDS-PAGE è spesso usato per testare la purezza della proteina dopo ogni fase di una serie. Poiché le proteine indesiderate vengono gradualmente rimosse dalla miscela, il numero di bande visualizzate sul gel SDS-PAGE viene ridotto, fino a quando non vi è solo una banda che rappresenta la proteina desiderata.
- Immunoblotting è una tecnica di visualizzazione delle proteine applicata in combinazione con cromatografia di affinità. Gli anticorpi per una specifica proteina sono usati come ligandi su una colonna per cromatografia di affinità. La proteina bersaglio viene trattenuta sulla colonna, quindi rimossa risciacquando la colonna con una soluzione salina o altri agenti. Gli anticorpi legati alle etichette radioattive o coloranti aiutano a rilevare la proteina bersaglio una volta separata dal resto della miscela.
fonti:
Zubay G. 1988. Biochimica, 2a edizione. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manuale di purificazione delle proteine, edizione AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Stati Uniti. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.