Cinetica enzimatica di misurazione
Come un po 'di background, gli enzimi sono proteine che agiscono come catalizzatori nel ridurre la quantità di energia di attivazione affinché una reazione si verifichi. L'energia di attivazione è l'energia necessaria per far sì che le reazioni "inizino" poiché molte reazioni non si verificano molto rapidamente (o si verificano affatto) se sono termodinamicamente possibili.
Gli enzimi catalizzano reazioni specifiche in un particolare sito (noto come sito attivo) in cui i reagenti si legano e reagiscono per generare i prodotti. I substrati hanno siti attivi specifici solo per loro in modo che nessun'altra sostanza si leghi o reagisca nello stesso sito. Come un lucchetto e una chiave, ogni enzima catalizzerà solo una reazione specifica (con alcune eccezioni).
L'attività specifica è utilizzata nei metodi di isolamento delle proteine per indicare la percentuale di purificazione. È importante conoscere questa unità quando si acquistano enzimi per indicare esattamente quanta parte dell'enzima puro si ottiene.
Quando si misura la cinetica enzimatica (la velocità di reazione di un enzima con un substrato o superficie), l'attività specifica è definita come la quantità di substrato che l'enzima converte (reazioni catalizzate), per mg di proteina nella preparazione enzimatica, per unità di tempo.
Un esempio di attività specifica sarebbe:
- L'attività specifica dell'enzima isolato è stata misurata a 150 umoli / min / mg di proteine prima della purificazione e 800 umoli / min / mg, dopo la purificazione.
L'attività specifica è una misura importante della purezza degli enzimi. Diversi lotti di un enzima puro dovrebbero avere gli stessi valori e anche la diluizione di una soluzione enzimatica molte volte avranno valori di attività specifici identici anche se ci saranno diversi valori di attività enzimatica. Questo perché nel calcolare l'attività specifica, il numeratore (unità / ml) e il denominatore (mg / ml) sono influenzati allo stesso modo.
L'attività specifica è molto diversa dall'attività, ma il calcolo dell'attività specifica dipende ancora dal valore dell'attività. Ciò significa che il valore dell'attività specifica dichiarata dipenderà anche dalla definizione dell'unità enzimatica.
I lotti di enzimi che hanno un valore di attività specifico inferiore al previsto possono contenere molecole di enzima che sono state alterate o mescolate con impurezze.
Fattori che influenzano l'attività enzimatica
È possibile che un enzima possa avere valori di attività misurati diversi se misurati in laboratori diversi (cioè differenze reali nell'attività misurata, differenze non evidenti causate dall'uso di definizioni di unità diverse).
Il modo in cui viene eseguito un test (il metodo di test per determinare la purezza degli enzimi) influenzerà i valori di attività riportati. Ad esempio, gli enzimi sono generalmente più attivi tra le temperature di 37 gradi Celsius rispetto a 20 gradi Celsius, quindi se un test viene eseguito a 21 gradi Celsius, i valori saranno diversi dai test condotti a una temperatura di 32 gradi Celsius (tipicamente , i test vengono eseguiti a una temperatura compresa tra 20 e 37 gradi Celsius).
Pertanto, la definizione dell'unità enzimatica sarebbe meglio espressa come 1 unità (U) è la quantità di enzima che catalizza la reazione di 1 nmol di substrato al minuto in condizioni standard.