La clonazione genica è l'atto di fare copie, o cloni, di un singolo gene. Una volta identificato un gene, i cloni possono essere utilizzati in molte aree della ricerca biomedica e industriale. L'ingegneria genetica è il processo di clonazione dei geni in nuovi organismi o di alterazione della sequenza del DNA per modificare il prodotto proteico. L'ingegneria genetica dipende dalla nostra capacità di eseguire le seguenti procedure essenziali.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Enzimi di restrizione
La scoperta di enzimi noti come endonucleasi di restrizione è stata essenziale per l'ingegneria delle proteine . Questi enzimi tagliano il DNA in punti specifici sulla base della sequenza nucleotidica. Centinaia di diversi enzimi di restrizione , in grado di tagliare il DNA in un sito distinto, sono stati isolati da molti diversi ceppi di batteri. Il DNA tagliato con un enzima di restrizione produce molti frammenti più piccoli, di varie dimensioni. Questi possono essere separati mediante elettroforesi su gel o cromatografia.
03 Elettroforesi
Purificare il DNA da una coltura cellulare, o tagliandolo usando gli enzimi di restrizione, non sarebbe di grande utilità se non potessimo visualizzare il DNA - cioè, trovare un modo per vedere se il tuo estratto contiene qualcosa o quale dimensione ti frammenta ce l'ho fatta. Un modo per farlo è tramite elettroforesi su gel. I gel sono usati per una varietà di scopi, dalla visualizzazione del DNA tagliato al rilevamento di inserti di DNA e knockout.
04 Unisciti a due pezzi di DNA
Nella ricerca genetica, è spesso necessario collegare due o più singoli filamenti di DNA, per creare un filamento ricombinante, o chiudere un filo circolare che è stato tagliato con enzimi di restrizione. Gli enzimi chiamati DNA ligasi possono creare legami covalenti tra catene di nucleotidi. Gli enzimi DNA polimerasi I e polinucleotide chinasi sono anche importanti in questo processo, per riempire gli spazi vuoti o fosforilare le estremità 5 ', rispettivamente.
05 Selezione del piccolo DNA auto-replicante
Piccoli pezzi circolari di DNA che non fanno parte di un genoma batterico, ma sono in grado di auto-replicarsi, sono noti come plasmidi. I plasmidi sono spesso usati come vettori per trasportare geni tra microrganismi. Nella biotecnologia, una volta che il gene di interesse è stato amplificato e sia il gene che il plasmide vengono tagliati dagli enzimi di restrizione, vengono legati insieme generando ciò che è noto come DNA ricombinante. Il DNA virale (batteriofago) può anche essere usato come vettore, così come i cosmidi, i plasmidi ricombinanti contenenti i geni del batteriofago.
06 Metodo per spostare un vettore in una cella ospite
Il processo di trasferimento di materiale genetico su un vettore come un plasmide, in nuove cellule ospiti, è chiamato trasformazione. Questa tecnica richiede che le cellule ospiti siano esposte a un cambiamento ambientale che le rende "competenti" o temporaneamente permeabili al vettore. L'elettroporazione è una di queste tecniche. Più grande è il plasmide, minore è l'efficienza con cui viene assorbito dalle cellule. I segmenti di DNA più grandi sono più facilmente clonati utilizzando batteriofagi, retrovirus o altri vettori virali o cosmidi in un metodo chiamato trasduzione. Il fago o i vettori virali sono spesso usati nella medicina rigenerativa, ma possono causare l'inserimento del DNA in parti dei nostri cromosomi dove non lo vogliamo, causando complicazioni e persino il cancro.
07 metodi per selezionare organismi transgenici
Non tutte le cellule prenderanno il DNA durante la trasformazione. È essenziale che ci sia un metodo per individuare quelli che lo fanno. In generale, i plasmidi contengono geni per la resistenza agli antibiotici e le cellule transgeniche possono essere selezionate in base all'espressione di questi geni e alla loro capacità di crescere su supporti contenenti quell'antibiotico. I metodi alternativi di selezione dipendono dalla presenza di altre proteine reporter come il sistema x-gal / lacZ o la proteina di fluorescenza verde, che consentono rispettivamente la selezione in base al colore e alla fluorescenza.