Che PCR ha a che fare con il sequenziamento del DNA e l'amplificazione dei geni
La reazione a catena della polimerasi ( PCR ) è una tecnica genetica molecolare per fare copie multiple di un gene ed è anche parte del processo di sequenziamento del gene.
Come funziona la reazione a catena della polimerasi?
Le copie geniche sono fatte usando un campione di DNA e la tecnologia è abbastanza buona per fare copie multiple da una singola copia del gene trovato nel campione. L'amplificazione PCR di un gene per fare milioni di copie, consente il rilevamento e l'identificazione di sequenze di geni usando tecniche visive basate su dimensioni e carica (+ o -) del pezzo di DNA.
In condizioni controllate, piccoli segmenti di DNA sono generati da enzimi noti come DNA polimerasi, che aggiungono i deossinucleotidi complementari (dNTP) a un pezzo di DNA noto come "modello". Anche i pezzi più piccoli di DNA, chiamati "primer" sono usati come punto di partenza per la polimerasi. I primer sono piccoli pezzi di DNA creati dall'uomo (oligomeri), di solito lunghi da 15 a 30 nucleotidi. Sono fatti conoscendo o indovinando brevi sequenze di DNA all'estremità del gene amplificato. Durante la PCR, il DNA che viene sequenziato viene riscaldato e i doppi fili si separano. Dopo il raffreddamento, i primer si legano allo stampo (chiamato ricottura) e creano un punto di partenza per la polimerasi.
La tecnica PCR
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata resa possibile dalla scoperta di termofili e enzimi polimerici termofili (enzimi che mantengono l'integrità strutturale e la funzionalità dopo il riscaldamento a temperature elevate).
I passaggi coinvolti nella tecnica di PCR sono i seguenti:
- Viene creata una miscela, con concentrazioni ottimizzate del modello di DNA, enzima polimerasi, primer e dNTP. La capacità di riscaldare la miscela senza denaturare l'enzima consente di denaturare la doppia elica del campione di DNA a temperature nell'intervallo di 94 gradi Celsius.
- Dopo la denaturazione, il campione viene raffreddato fino a un intervallo più moderato, intorno a 54 gradi, che facilita la ricottura (legatura) dei primer ai modelli di DNA a filamento singolo.
- Nella terza fase del ciclo, il campione viene riscaldato a 72 gradi, la temperatura ideale per Taq DNA Polymerase, per l'allungamento. Durante l'allungamento, la DNA polimerasi utilizza il singolo filamento di DNA originale come modello per aggiungere dNTP complementari alle estremità 3 'di ogni primer e generare una sezione di DNA a doppio filamento nella regione del gene di interesse.
- I primer che hanno ricotto a sequenze di DNA che non sono una corrispondenza esatta non rimangono ricotti a 72 gradi, limitando così l'allungamento al gene di interesse.
Questo processo di denaturazione, ricottura e allungamento viene ripetuto più volte (30-40), aumentando così esponenzialmente il numero di copie del gene desiderato nella miscela. Anche se questo processo sarebbe piuttosto noioso se eseguito manualmente, i campioni possono essere preparati e incubati in un termociclatore programmabile, ormai comune nella maggior parte dei laboratori molecolari, e una reazione PCR completa può essere eseguita in 3-4 ore.
Ogni fase di denaturazione interrompe il processo di allungamento del ciclo precedente, troncando così il nuovo filamento di DNA e mantenendolo a circa la dimensione del gene desiderato.
La durata del ciclo di allungamento può essere allungata o ridotta a seconda delle dimensioni del gene di interesse, ma alla fine, attraverso cicli ripetuti di PCR, la maggior parte dei modelli sarà limitata alle dimensioni del gene di interesse da solo, poiché sarà generato dai prodotti di entrambi i primer.
Esistono diversi fattori per la PCR di successo che possono essere manipolati per migliorare i risultati. Il metodo più utilizzato per testare la presenza del prodotto della PCR è l' elettroforesi su gel di agarosio . Che viene utilizzato per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni e alla carica. I frammenti vengono quindi visualizzati usando coloranti o radioisotopi.
L'evoluzione
Dalla scoperta della PCR, sono state scoperte DNA polimerasi diverse dalla Taq originale. Alcuni di questi hanno una migliore capacità di "correzione delle bozze" o sono più stabili a temperature più elevate, migliorando così la specificità della PCR e riducendo gli errori dall'inserimento del dNTP errato.
Alcune varianti di PCR sono state progettate per applicazioni specifiche e sono ora utilizzate regolarmente nei laboratori di genetica molecolare. Alcuni di questi sono PCR Real-Time e PCR con trascrittasi inversa. La scoperta della PCR ha anche portato allo sviluppo di sequenziamento del DNA, impronte digitali del DNA e altre tecniche molecolari.