Le modifiche a uno qualsiasi dei componenti di una reazione di reazione a catena della polimerasi (PCR) possono alterare la qualità del risultato, migliorando o diminuendo la resa e la qualità del prodotto o migliorando la specificità e la sensibilità della reazione. I parametri che influenzano il risultato finale possono essere fisici (cioè temperatura, tempi di ciclo) o chimici (cioè concentrazione di maschere, tipo di enzima utilizzato). Di seguito sono riportati alcuni fattori chiave che influenzano il successo della PCR.
01 Pulizia delle condizioni di laboratorio
Poiché la PCR è in grado di rilevare una singola molecola di DNA, è importante mantenere condizioni incontaminate in laboratorio. Indossare sempre guanti nuovi, usare vetro sterile, tubi e puntali per pipette e soluzioni sterili e pulire l'area di lavoro prima di iniziare il lavoro.
Includere sempre le reazioni di controllo, senza DNA del modello e senza enzima, per garantire che i risultati siano realmente dovuti all'amplificazione del campione giusto.
La maggior parte delle persone si assicura di avere il proprio set di soluzioni che non sono condivise per facilitare la risoluzione dei problemi e le pipette designate sono spesso riservate solo per PCR. Le provette per PCR prive di DNase e RNase, i puntali per pipette resistenti agli aerosol e il funzionamento in una cappa chimica con luce UV sono anche modi per ridurre al minimo i problemi.
02 Componenti chimici
- Hanno 18-24 basi
- Non avere una struttura secondaria (ad es. Anelli a forcella)
- Hanno una distribuzione equilibrata di coppie G / C e A / T
- Non sono complementari l'uno all'altro alle estremità di 3 piedi
- Hanno temperature di fusione (Tm) di circa 5-10 gradi Celsius al di sotto della temperatura di annealing, che di solito è compresa tra 55 e 65 gradi Celsius
La Tm per entrambi i primer dovrebbe essere simile per i migliori risultati.
03 Reaction Mix: Template e Primers
Le concentrazioni ottimali del primer sono comprese tra 0,1 e 0,6 micromoli / L. La quantità di modello varia a seconda del tipo di DNA (umano, batterico, plasmidico).
Con quantità di template molto basse, ci sono altre strategie per migliorare i risultati, come numeri di cicli maggiori o l'uso di "hot start". Testare sempre nuovi primer con una reazione di controllo positiva, per essere certi che funzionino in base alle specifiche condizioni sperimentali.
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
La concentrazione di MgCl2 nella miscela di reazione può influenzare l'esito della PCR e potrebbe svolgere un ruolo importante in reazioni più fastidiose. Il catione di magnesio forma complessi solubili con dNTP per produrre il substrato effettivo riconosciuto dall'enzima polimerasi.
Uguali quantità di tutti e quattro i dNTP aiutano anche a ridurre il tasso di errore della polimerasi. Alcuni additivi come betaina, BSA, detergenti, DMSO, glicerolo e pirofosfatasi possono anche influenzare la specificità enzimatica o l'efficienza della reazione.
05 Tipo di termociclatore
Quando si acquistano attrezzature da laboratorio, tenere presente che alcuni termociclatori sono meno precisi di altri nel mantenere le temperature esatte e desiderate.
Questo è un settore in cui andare a buon mercato non ti ripaga a lungo termine quando ti trovi di fronte a una reazione pignola o usando primer che richiedono una gamma ristretta di temperature di ricottura.
Tubi di reazione a parete sottile progettati per adattarsi alla marca precisa di termociclatore che stai utilizzando, aiutano anche a ottimizzare le temperature di reazione.
06 Impostazioni del ciclo
L'aumento della resa può essere ottenuto aumentando il tempo di estensione circa ogni 20 cicli, per compensare meno enzima per amplificare più modelli. Di solito, meno di 40 cicli sono sufficienti per amplificare meno di 10 molecole di modello ad una concentrazione abbastanza grande da poter essere vista su un gel di agarosio colorato con bromuro di etidio.