Sviluppato nel 1983, il processo di PCR ha reso possibile eseguire il sequenziamento del DNA e identificare l'ordine dei nucleotidi nei singoli geni.
Il metodo utilizza il ciclo termico o il riscaldamento e il raffreddamento ripetuti della reazione per la fusione e la replicazione del DNA. Mentre la PCR continua, il "nuovo" DNA viene usato come modello per la replicazione e ne consegue una reazione a catena, amplificando esponenzialmente il modello del DNA.
Le tecniche di PCR sono applicate in molte aree della biotecnologia, compresa l'ingegneria proteica , la clonazione, la medicina legale (impronte digitali del DNA), i test di paternità, la diagnosi di malattie ereditarie e / o infettive e l'analisi di campioni ambientali.
In ambito forense, in particolare, la PCR è particolarmente utile perché amplifica anche la più piccola quantità di evidenza del DNA. La PCR può anche essere utilizzata per analizzare il DNA che ha migliaia di anni e queste tecniche sono state utilizzate per identificare qualsiasi cosa, da un mammut di 800.000 anni alle mummie di tutto il mondo.
La procedura PCR è la seguente:
- Inizializzazione: questo passaggio è necessario solo per DNA polimerasi che richiedono la PCR hot-start. La reazione viene riscaldata tra 94 e 96 ° C e mantenuta per 1-9 minuti.
- Denaturazione: se la procedura non richiede l'inizializzazione, la denaturazione è il primo passo. La reazione viene riscaldata a 94-98 ° C per 20-30 secondi. I legami di idrogeno della matrice del DNA vengono interrotti e vengono create molecole di DNA a filamento singolo.
- Ricottura: la temperatura di reazione è inferiore a tra 50 e 65 ° C e mantenuta per 20-40 secondi. I primer si riconducono al modello di DNA a filamento singolo. La temperatura è estremamente importante durante questo passaggio. Se fa troppo caldo, il primer potrebbe non legarsi. Se fa troppo freddo, il primer potrebbe legarsi imperfettamente. Un buon legame si forma quando la sequenza di primer corrisponde strettamente alla sequenza del modello.
- Estensione / allungamento: la temperatura durante questa fase varia a seconda del tipo di polimerasi. La DNA polimerasi sintetizza un filamento di DNA completamente nuovo.
- Allungamento finale: questo passaggio viene eseguito a 70-74 ° C per 5-15 minuti dopo il ciclo di PCR finale.
- Sospensione finale: questo passaggio è facoltativo. La temperatura è mantenuta a 4-15 ° C e si concentra la reazione.
La procedura è divisa in tre fasi:
- Amplificazione esponenziale: durante ogni ciclo, il prodotto (lo specifico pezzo di DNA che viene replicato) viene raddoppiato.
- Fase di livellamento: quando la DNA polimerasi perde attività e consuma reagenti, la reazione rallenta.
- Plateau: nessun altro prodotto si accumula.