Il sequenziamento del DNA dipende anche dalla nostra capacità di utilizzare l'elettroforesi su gel per separare i filamenti di DNA che differiscono nelle dimensioni di un solo paio di basi.
Sequenziamento del DNA
Alla fine degli anni '70 furono inventate due tecniche di sequenziamento del DNA per molecole di DNA più lunghe. Questi erano il metodo Sanger (o dideoxy) e il metodo Maxam-Gilbert (clancaggio chimico). Il metodo Maxam-Gilbert si basa sulla scissione di nucleotidi specifici per sostanze chimiche ed è il metodo migliore per sequenziare gli oligonucleotidi (polimeri a breve nucleotide, solitamente più piccoli di 50 coppie di basi in lunghezza). Il metodo Sanger è più comunemente usato perché è stato dimostrato tecnicamente più facile da applicare e, con l' avvento della PCR e dell'automazione della tecnica, è facilmente applicabile a lunghi filamenti di DNA compresi alcuni interi geni. Questa tecnica è basata sulla terminazione della catena da parte dei dideossinucleotidi durante le reazioni di allungamento della PCR.
Metodo Sanger
Nel metodo Sanger, il filamento di DNA da analizzare viene utilizzato come modello e la DNA polimerasi viene utilizzata, in una reazione PCR, per generare filamenti complementari utilizzando primer.
Vengono preparate quattro diverse miscele di reazione PCR, ciascuna contenente una certa percentuale di analoghi di dideoxinucleoside trifosfato (ddNTP) a uno dei quattro nucleotidi (ATP, CTP, GTP o TTP). La sintesi del nuovo filamento di DNA continua fino a quando uno di questi analoghi non viene incorporato, momento in cui il filo viene troncato prematuramente.
Ciascuna reazione di PCR finirà per contenere una miscela di diverse lunghezze di filamenti di DNA, il tutto terminando con il nucleotide che è stato marcato con il didexy per quella reazione. L' elettroforesi su gel viene quindi utilizzata per separare i trefoli delle quattro reazioni, in quattro corsie separate, e determinare la sequenza del modello originale in base a quale lunghezza dei trefoli termina con quale nucleotide.
Nella reazione Sanger automatizzata, vengono utilizzati primer etichettati con quattro diversi tag fluorescenti colorati. Le reazioni di PCR, in presenza dei diversi nucleotidi di dideossi, vengono eseguite come descritto sopra. Tuttavia, in seguito, le quattro miscele di reazione vengono quindi combinate e applicate a una singola corsia di un gel. Il colore di ciascun frammento viene rilevato utilizzando un raggio laser e le informazioni vengono raccolte da un computer che genera cromatogrammi che mostrano picchi per ciascun colore, da cui è possibile determinare la sequenza del DNA del modello.
In genere, il metodo di sequenziamento automatico è accurato solo per sequenze fino a un massimo di circa 700-800 coppie di basi in lunghezza. Tuttavia, è possibile ottenere sequenze complete di geni più grandi e, di fatto, interi genomi, usando metodi step-saggio come il sequenziamento di Primer Walking e Shotgun.
In Primer Walking , una porzione lavorabile di un gene più grande viene sequenziata usando il metodo Sanger. I nuovi primer sono generati da un segmento affidabile della sequenza e usati per continuare a sequenziare la porzione del gene che era fuori dalla portata delle reazioni originali.
Il sequenziamento del fucile a pompa comporta il taglio casuale del segmento di interesse del DNA in frammenti più appropriati (gestibili) di dimensioni, il sequenziamento di ciascun frammento e la disposizione dei pezzi in base a sequenze sovrapposte. Questa tecnica è stata facilitata dall'applicazione di software per organizzare i pezzi sovrapposti.