Come realizzare questo tampone colorante immunoistochimico
La soluzione tampone fosfato (PBS) è una soluzione tampone comunemente utilizzata per la colorazione immunoistochimica (IHC) ed è spesso utilizzata nella ricerca biologica. La PBS è una soluzione salina a base acquosa contenente sodio idrogeno fosfato, sodio cloruro e, in alcuni casi, cloruro di potassio e potassio diidrogeno fosfato.
Colorazione immunoistochimica
L'immunoistochimica si riferisce al processo di rilevazione di antigeni come le proteine nelle cellule di una sezione tissutale utilizzando il principio degli anticorpi che si legano specificamente agli antigeni nei tessuti biologici.
La colorazione immunofluorescente è stato il primo metodo di colorazione immunoistochimica.
Gli antigeni diventano visibili quando coniugati con anticorpi che usano coloranti fluorescenti a causa di una reazione di legame antigene-anticorpo Questo processo si verifica quando viene attivato dalla luce eccitante di una specifica lunghezza d'onda al microscopio a fluorescenza.
Le concentrazioni di osmolarità e ioni delle soluzioni corrispondono a quelle del corpo umano: sono isotoniche.
Una ricetta per PBS
Puoi preparare PBS in diversi modi. Ci sono più formule. Alcuni di loro non contengono potassio, mentre altri contengono calcio o magnesio .
Questa ricetta è relativamente facile. È per la soluzione stock 10X PBS (0.1M). Tuttavia, puoi anche creare una soluzione stock 1X o iniziare con questa ricetta 10X e diluirla in 1X.
L'intero processo dura circa 10 minuti.
Viene inoltre fornita un'opzione per aggiungere Tween.
Cosa devi fare Buffer PBS
- Sodio fosfato monobasico (anidro)
- Sodio fosfato dibasico (anidro)
- Cloruro di sodio
- Scala e pesa le barche
- Agitatore magnetico e agitatore
- Una sonda pH calibrata e soluzioni adeguate per la regolazione del pH
- Pallone volumetrico 1L
- Tween 20 (opzionale)
Come preparare il tampone fosfato salino (PBS)
Pesare 10,9 g di fosfato di sodio anidro dibasico (Na2HPO4), 3,2 g di fosfato di sodio anidro monobasico (NaH2PO4) e 90 g di cloruro di sodio (NaCl).
Sciogliere in poco meno di 1L di acqua distillata.
Regolare il pH a 7.4 e portare la soluzione a un volume finale di 1 litro.
Diluire 10 volte prima dell'uso e regolare nuovamente il pH se necessario.
È possibile creare una soluzione PBS contenente lo 0,5% di Tween 20 aggiungendo 5 ml di Tween 20 alla soluzione 1L.
Suggerimenti per creare buffer PBS
Conservare il buffer a temperatura ambiente dopo aver realizzato la soluzione PBS.
I reagenti non anidri possono essere sostituiti, ma è necessario ricalcolare la massa appropriata di ciascuno per accogliere le molecole di acqua aggiunte.
Usi di fosfato tamponato salino (PBS)
La soluzione salina tamponata con fosfato ha molti usi perché è isotonica e non tossica per la maggior parte delle cellule. Può essere usato per diluire le sostanze ed è spesso usato per sciacquare contenitori di cellule. La PBS può essere usata come un diluente in vari metodi per essiccare le biomolecole perché le molecole d'acqua al suo interno saranno strutturate intorno alla sostanza-proteina, per esempio. Sarà "asciugato" e immobilizzato su una superficie solida.
Il pH rimane costante e coerente per prevenire la distruzione delle cellule.
Il film sottile di acqua che si lega alla sostanza previene la denaturazione o altri cambiamenti conformazionali. I tamponi carbonatici possono essere utilizzati per lo stesso scopo ma con minore efficacia.
La PBS può anche essere usata per prendere uno spettro di riferimento quando si misura l'adsorbimento di proteine nell'ellipsometria.